단백질체와 대사체의 결합 분석을 통해 microRNA에 대한 통찰력 제공

Aug 02, 2023

기생충 및 벡터 16권, 기사 번호: 271(2023) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

병원성 바이러스는 척추동물로부터 혈액을 섭취하는 동안 암컷 Aedes aegypti(Ae. aegypti) 모기에 의해 전염될 수 있습니다. 모기 및 중장 특이적 마이크로RNA(miRNA) 1174(miR-1174)의 침묵은 혈액 섭취를 손상시키고 사망률을 증가시킵니다. miR-1174 고갈에 반응하는 단백질과 대사산물의 정체를 확인하면 모기의 혈액 공급 및 영양 대사를 조절하는 이 miRNA의 분자 메커니즘에 대한 이해가 높아질 것입니다.

안티센스 올리고뉴클레오티드(안타고미르[Ant]) Ant-1174 및 Ant-Ct를 암컷 Ae에 주입했습니다. 폐쇄 후 12~20시간에 aegypti 모기에 감염되었으며, miR-1174의 고갈은 역전사 정량적 실시간 PCR(RT-qPCR)을 통해 확인되었습니다. Ant-1174 주입 및 대조 모기는 차등적으로 발현된 단백질과 대사 산물을 각각 식별하기 위해 직렬 질량 태그 기반 단백질체 분석 및 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 비표적 대사체 분석을 위해 주입 후 72시간에 혈액 식사 전에 수집되었습니다. 이중 가닥 RNA(dsRNA) 주입을 사용한 RNA 간섭(RNAi)을 적용하여 차별적으로 발현되는 유전자의 생물학적 역할을 조사했습니다. RNAi 효과는 RT-qPCR 및 웨스턴 블랏 분석을 통해 검증되었습니다. 제조업체의 지침에 따라 적절한 분석 키트를 사용하여 트리글리세리드 함량과 ATP 수준을 측정했습니다. Student's t-test를 사용하여 GraphPad7 소프트웨어로 통계 분석을 수행했습니다.

모기 및 중장 특이적 miR-1174가 고갈되면 총 383개의 차별적으로 발현된 단백질(DEP)이 확인되었으며, 그 중 258개는 상향 조절되었고 125개는 하향 조절되었습니다. GO(Gene Ontology) 및 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 농축을 사용한 이러한 DEP의 기능적 분석은 miR-1174가 아미노산 대사, 뉴클레오티드 대사, 지방산 대사 및 당 대사 경로에서 중요한 규제 역할을 한다는 것을 시사했습니다. 총 292개의 차등 대사산물이 확인되었으며, 그 중 141개는 상향 조절되었고 151개는 하향 조절되었습니다. 통합 분석에 따르면 관련 차등 단백질과 대사 산물은 주로 해당과정, 구연산염 순환, 산화적 인산화 및 아미노산 대사를 포함한 다양한 대사 경로에서 풍부해졌습니다. 구체적으로, miR-1174가 고갈된 모기에서 상향조절된 단백질 중 하나인 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제(PNP; AAEL002269)의 유전자는 퓨린, 피리미딘 및 니아신-니코틴아미드 대사 경로와 연관되어 있습니다. PNP 녹다운은 혈액 소화와 난소 발달을 심각하게 억제하고 성인 사망률을 증가시켰습니다. 기계적으로 PNP 고갈은 vitellogenin 유전자(Vg)의 상당한 하향 조절을 가져왔습니다. 또한 난소 발달과 관련된 ecdysone 신호 전달 및 인슐린 유사 펩타이드 신호 전달 경로의 일부 중요한 유전자가 영향을 받았습니다.

이 연구는 miR-1174가 고갈된 Ae에서 단백질과 대사산물의 차등적 축적을 보여줍니다. 단백질체학 및 대사체학 기술을 사용하는 이집트 모기. 결과는 장 생리학적 활동에서 상향조절된 유전자 PNP의 역할에 대한 기능적 증거를 제공합니다. 우리의 연구 결과는 miR-1174가 고갈된 Ae의 주요 분자 변화를 강조합니다. aegypti 모기를 연구하여 모기 벡터의 계통 특이적 miRNA와 관련된 분자 메커니즘에 대한 이해를 높이기 위한 기초와 새로운 통찰력을 제공합니다.

벡터 모기 종의 암컷은 척추동물로부터 혈액을 채취하여 알 발달에 필요한 아미노산과 기타 영양소를 얻습니다. 결과적으로 그들은 수많은 바이러스 병원체의 벡터 역할을 합니다. 세계적인 도시화와 지속적인 기후 온난화로 인해 모기 매개 질병의 위험이 전 세계적으로 증가하고 있으며, 이는 공중 보건에 심각한 문제를 야기하고 많은 국가에 상당한 경제적 부담을 안겨주고 있습니다[1]. 지난 몇 년 동안 유전자 조작을 기반으로 모기 매개체를 통제하기 위한 일련의 유망한 전략과 기술이 수용되고 있습니다[2,3,4,5]. 그러나 효과적인 의료 개입이 부족하여 대부분의 모기 매개 질병의 예방과 통제가 여전히 제한되고 있습니다.

1.2, as described in other studies [13,14,15,16] (Additional file 3: Table S3). The DEPs were subjected to GO enrichment [17] and KEGG pathway enrichment analyses [18]./p> 1 and P < 0.05 (unpaired two-sided Student’s t-tests) in the OPLS-DA model were considered to be differentially expressed metabolites (DEMs). Volcano plots and a hierarchically clustered heatmap were plotted to visualize significant features of the identified DEMs. Commercial databases, including KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) and MetaboAnalyst 5.0 (http://www.metaboanalyst.ca/), were used for pathway enrichment analysis. Finally, integrated analysis of the proteome and metabolome was performed for the differential proteins and metabolites./p> 1.8 was considered to be satisfactory for subsequent experiments. The integrity of the extracted RNA was checked by 1% agarose gel electrophoresis. All primer pairs for the real time quantitative PCR (RT-qPCR) amplification of genes were designed using the software Primer Premier 5.0 and then synthesized at Sangon Biotech (Shanghai, China) (Additional file 7: Table S7). To examine the expression of the protein-coding genes, 1 µg of total RNA was reverse-transcribed into complementary DNA (cDNA) using the SuperScript™ IV First-Strand Synthesis System (TaKaRa Bio Inc., Otsu, Shiga, Japan). RT-qPCR was performed using TB Green Premix Ex Taq TM II (Tli RNaseH Plus; TaKaRa Bio Inc.). The reaction volume (20 µl) contained 10 µl of 2× NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus (Tiangen Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China), 0.8 µl of 10 µM primers, 0.4 µl ROX Dye II, 2 µl diluted cDNA and 6.8 µl ddH2O. Ribosomal protein S7 (RPS7; AAEL009496-RA) served as the internal control. Reactions were conducted on an ABI7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). The amplification procedure was: pretreatment at 95 °C for 1 min; followed by 40 cycles of 95 °C for 1 min and 60 °C for 1 min; ending with the generation of the dissolution curves at 95 °C for 15 s, 60 °C for 1 min and 95 °C for 15 s. To examine the expression level of miR-1174, 1 µg of total RNA was reverse-transcribed into cDNA using the SynScript® III miRNA RT SuperMix (TSK3001; Tsingke Biotechnology Co.,Ltd., Beijing, China). RT-qPCR was performed using a miRNA Universal SYBR qPCR Mix (TSE2001; Tsingke Biotechnology Co., Ltd.). The total reaction volume (20 µl) contained 10 µl of miRNA Universal SYBR qPCR Mix (Tsingke Biotechnology Co., Ltd.), 0.8 µl of 10 µM primers, 0.4 µl of 50× ROX Reference Dye II, 2 µl of diluted cDNA and 6.8 µl of ddH2O. Small nuclear RNA (snRNA) U6 (AAEL029000-RA) was used as the internal control. Reactions were conducted on the ABI7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) using the following amplification procedure: pretreatment at 95 °C for 1 min; followed by 40 cycles of 95 °C for 10 s and 60 °C for 30 s; ending with the generation of the dissolution curves at 95 °C for 15 s, 60 °C for 1 min and 95 °C for 15 s./p> 1.2, as used in other studies [13,14,15,16], we determined 383 DEPs, of which 258 were upregulated and 125 were downregulated (Fig. 1c; Additional file 8: Table S8). Hierarchical cluster analysis showed that these 383 DEPs were separated into upregulated and downregulated clades, and that the Ant-1174 group was differentiated from the control group (Fig. 1d); thus, miR-1174 depletion substantially caused a global protein expression response in mosquitoes./p> 1.2 or < 0.83, P < 0.05) illustrating the proteins differentially expressed between the Ant-1174 and control groups. The significantly upregulated differentially expressed proteins are shown in red, the significantly downregulated differentially expressed proteins are shown in blue and the proteins with no significant difference are shown in gray. d Hierarchical clustering analysis of the differentially expressed proteins visualized as a heatmap. The color blocks in different positions represent the relative expression of the corresponding proteins: red represents high expression and blue represents low expression. e Bubble chart showing GO enrichment of Ant-1174 vs Control. f KEGG pathways enriched by differentially expressed proteins between Ant-1174 and control group. Ant-1174/Ant-Ct, antisense oligonucleotides (antagomirs) Ant-1174/Ant-Ct; BP, biological Process; CC, cellular component; GO, Gene Ontology; KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; MF, molecular function; miRNA-1174, microRNA-1174; PIJ, postinjection; WT, wild type/p> 1 and P value (in a Student’s t-test) < 0.05 yielded 292 differential metabolites, of which 141 were upregulated and 151 were downregulated (Fig. 2d; Additional file 9: Table S9). Hierarchical clustering analysis of these differential metabolites showed that samples of the same group were clustered in one clade and those of different groups were separated from each other (Fig. 2e; Additional file 10: Table S10). The upregulated metabolites could be divided into 10 super classes, of which the top five were organic acids and their derivatives; lipids and lipid-like molecules; organoheterocyclic compounds; organic oxygen compounds; and benzenoids (Fig. 2f; Additional file 11: Table S11). The downregulated metabolites could be divided into 11 super classes, of which the top five were organic oxygen compounds; organic acids and derivatives; lipids and lipid-like molecules; organoheterocyclic compounds; and nucleosides, nucleotides and analogs (Fig. 2f; Additional file 11: Table S11). In the super class organic acids and derivatives, 41 metabolites (76%) of POS mode and 24 metabolites (69%) of NEG mode belonged to the subclass amino acids, peptides and analogs. In the super class organic oxygen compounds, eight metabolites (62%) of POS mode and 29 metabolites (81%) of NEG mode belonged to the subclass carbohydrates and carbohydrate conjugates. We then performed a KEGG pathway enrichment analysis of these DEMs (Fig. 2g; Additional file 12: Table S12), which revealed that the DEMs were mainly enriched in the pathway aminoacyl-tRNA biosynthesis, followed by purine metabolism, glycerophospholipid metabolism, galactose metabolism, pyrimidine metabolism, glycine, serine and threonine metabolism, arginine and proline metabolism, pentose and glucuronate interconversions, alanine, aspartate and glutamate metabolism, cysteine and methionine metabolism, lysine degradation, amino sugar and nucleotide sugar metabolism, sphingolipid metabolism and glyoxylate and dicarboxylate metabolism./p>

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